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基因編輯動(dòng)物凈化之——基因型鑒定
各位童鞋，考考你們基因工程小鼠成功繁育之后應(yīng)該做什么呢?
機(jī)智的你們一定能想到是基因型鑒定啦!
基因型鑒定在基因工程小鼠應(yīng)用中不可或缺，在很多同學(xué)眼里這可能是一項(xiàng)基礎(chǔ)性的工作，但實(shí)際上里面有N多小細(xì)節(jié)需要注意，下面就由小編帶你一起get小鼠基因型鑒定吧!
一、小鼠尾基因組DNA的制備
提到基因型鑒定，腦海中是不是閃現(xiàn)出“鼠尾DNA提取 PCR”的關(guān)鍵詞呢?
沒錯(cuò)，鼠尾基因組DNA的制備是基因型鑒定的第一步，也是整個(gè)實(shí)驗(yàn)中至關(guān)重要的步驟，其中有很多容易忽視的地方需要我們注意哦!
1. 樣本準(zhǔn)備
在基因型鑒定中，小鼠基因組DNA的制備是決定實(shí)驗(yàn)結(jié)果好壞的關(guān)鍵。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，一般選擇在小鼠出生3-4周剪尾。
注意：① 鼠尾尾尖(<5mm)可獲得的DNA量足夠用于基因型鑒定。
?、?剪鼠尾的剪刀每剪完一次需用酒精棉擦拭，避免DNA交叉污染。
?、?避免鼠尾樣本帶有血液。
2. DNA抽提
1)將鼠尾剪碎，離心管中加入500uL裂解液和適量15 uL蛋白酶K(10 mg/mL)。
2)樣本浸于溶液中并充分振蕩混勻，置于55℃恒溫加熱儀。
3)加入500uL DNA提取飽和酚和500uL核酸提取液，12000 rpm離心10 min，離心后將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中。
4)上清中加入1mL無水乙醇(約2倍體積)，上下輕晃，直至出現(xiàn)絮凝的DNA沉淀，8000 rpm離心3 min，棄上清。
5)加75%的酒精1mL洗滌，12000 rpm離心5 min，棄上清，留沉淀，倒置干燥5 min。
6)加入200 µL DEPC水(可根據(jù)DNA量調(diào)節(jié))，使沉淀完全溶解，于-20℃保存?zhèn)溆?。DNA 樣品的 OD260/280 在 1.8-2.0 之間。
注意：① 需要充分裂解鼠尾，樣本應(yīng)消化至肉眼看不到大顆粒為止。
?、?DNA模板濃度應(yīng)控制在50-100ng/ul進(jìn)行PCR。
二、PCR
成功的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不僅需要高質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)濃度的DNA，根據(jù)產(chǎn)物GC的含量還需要選擇合適的PCR酶。在基因工程小鼠鑒定中，使用常規(guī)的PCR酶不一定能得到好的結(jié)果，往往需要用到特殊的PCR酶，一般在定制的基因工程小鼠鑒定方案中會(huì)指出適合的PCR酶。
讓我們一起看看基因工程小鼠的鑒定方案吧~
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雙轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定方案 |
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|
Primer |
Sequence 5' --> 3' |
Primer Type |
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|
oIMR1644 |
5'-AATAGAGAACGGCAGGAGCA-3' |
Transgene |
||
|
oIMR1645 |
5'-GCCATGAGGGCACTAATCAT-3' |
Transgene |
||
|
42 |
CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT |
Internal Positive Control Forward |
||
|
43 |
GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC |
Internal Positive Control Reverse |
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PCR Reaction System
|
Reaction Conponent |
Volum（μL） |
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|
10X Buffer |
2.5 |
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|
ddH2O |
16.75 |
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|
Primer |
1 |
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|
Primer |
1 |
|||
|
Mg2+ |
2 |
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|
dNTPs |
0.5 |
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|
Taq |
0.25 |
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|
Template |
1 |
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Total |
25 |
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phanta Max from Takara |
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Cycling Reaction |
Step |
Temp |
Time |
Cycle |
|
1 |
95 |
5min |
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2 |
95 |
30sec |
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|
3 |
60-65 |
30sec |
|
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4 |
72 |
40sec |
Goto step 2, 40 cycles |
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5 |
72 |
5min |
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6 |
10 |
Hold |
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Gentype |
TG：608bp Control：324bp |
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注意：設(shè)置對(duì)照Control非常重要，不僅可以幫我們快速鑒別基因型，還可以輔助我們判斷PCR體系是否正常。
如何避免PCR污染
1)實(shí)驗(yàn)開始前75%酒精消毒工作臺(tái)、手套和移液槍表面。
2)大包裝試劑提前分裝，例如無菌水用1.5mlEP管分裝，防止因反復(fù)使用造成的污染。
3)配置PCR反應(yīng)體系時(shí)及時(shí)更換槍頭，切勿將移液槍身伸進(jìn)試劑瓶?jī)?nèi)。
三、瓊脂糖凝膠電泳TIPs
跑膠時(shí)容易出現(xiàn)各種各樣的狀況，DNA條帶模糊、拖尾甚至沒有條帶的情況。以下有幾個(gè)小技巧可以避免這些情況的發(fā)生：
1)長(zhǎng)期使用的DNA放4℃保存，避免DNA反復(fù)凍融。
2)凝膠電泳DNA上樣量不是越多越好。出現(xiàn)條帶模糊拖尾時(shí)，應(yīng)適當(dāng)減少上樣量。
3)電泳緩沖液需要經(jīng)常更換，電泳時(shí)電壓不超過20 V/cm，溫度<30℃。
4)加樣時(shí)緩慢滴入，等樣品自然沉降后再加電壓。
上就是小鼠基因型鑒定的大致流程和需要注意的小細(xì)節(jié)，你get到了嗎?如果有任何問題，歡迎致電0731-84876042和專業(yè)技術(shù)人員咨詢!
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